单细胞转录组整合分析——seurat包---生信菜鸟团

Seurat是一个分析转录组数据的R包，我们之前的推文对其进行过描述：

Seurat 学习笔记

该包于去年新推出了整合功能。文章19年6月份发表于cell杂志，原文题目为：Comprehensive Integration of Single-Cell Data 被引量超过300次

我们一起来看一下。

该方法的目的是识别不同数据集中存在的共享细胞状态，即使它们是从不同的个体、实验条件、技术甚至物种中收集来的。

重点是找到不同数据集中的锚点anchors，这些“锚点”然后用于协调数据集，或将信息从一个数据集传输到另一个数据集。

步骤如下：

数据预处理

作者把单细胞数据放在了SeuratData等一系列包中，如果你的网速不行，可以直接到网页下载数据。

library(Seurat) #devtools::install_github('satijalab/seurat-data') library(SeuratData) #InstallData("panc8") #data("panc8") load('panc8.SeuratData/data/panc8.rda') #To construct a reference, we will identify ‘anchors’ between the individual datasets. #首先，将组合的数据分成列表，每个数据集是单独的元素 pancreas.list <- SplitObject(panc8, split.by = "tech") pancreas.list <- pancreas.list[c("celseq", "celseq2", "fluidigmc1", "smartseq2")]

对数据先进行标准化，并识别variable feature。

for (i in 1:length(pancreas.list)) { pancreas.list[[i]] <- NormalizeData(pancreas.list[[i]], verbose = FALSE) pancreas.list[[i]] <- FindVariableFeatures(pancreas.list[[i]], selection.method = "vst", nfeatures = 2000, verbose = FALSE) }

整合3个胰岛细胞数据集

整合三个数据集作为参考，并使用FindIntegrationAnchors函数识别锚点。参数默认。

reference.list <- pancreas.list[c("celseq", "celseq2", "smartseq2")] pancreas.anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = reference.list, dims = 1:30)

然后我们将这些锚点传递给IntegrateData函数，该函数返回一个Seurat对象。

pancreas.integrated <- IntegrateData(anchorset = pancreas.anchors, dims = 1:30)

现在我们得到了seurat对象——一个整合后的表达矩阵pancreas.integrated。

然后我们可以使用这个新的表达矩阵进行下游分析和可视化。

包括进行标准化，运行PCA，并使用UMAP可视化结果。

library(ggplot2) library(cowplot) # switch to integrated assay. The variable features of this assay are automatically # set during IntegrateData DefaultAssay(pancreas.integrated) <- "integrated" # Run the standard workflow for visualization and clustering pancreas.integrated <- ScaleData(pancreas.integrated, verbose = FALSE) pancreas.integrated <- RunPCA(pancreas.integrated, npcs = 30, verbose = FALSE) pancreas.integrated <- RunUMAP(pancreas.integrated, reduction = "pca", dims = 1:30) p1 <- DimPlot(pancreas.integrated, reduction = "umap", group.by = "tech") p2 <- DimPlot(pancreas.integrated, reduction = "umap", group.by = "celltype", label = TRUE, repel = TRUE) + NoLegend() plot_grid(p1, p2)

左图按照技术聚类，右图按照细胞类型聚类。

使用参考数据集进行细胞类型分类

找到锚点之后，我们使用TransferData函数基于参考数据寻找细胞。

pancreas.query <- pancreas.list[["fluidigmc1"]] pancreas.anchors <- FindTransferAnchors(reference = pancreas.integrated, query = pancreas.query, dims = 1:30) predictions <- TransferData(anchorset = pancreas.anchors, refdata = pancreas.integrated$celltype, dims = 1:30) pancreas.query <- AddMetaData(pancreas.query, metadata = predictions)

因为我们有来自完整整合分析的原始标签注释，所以我们可以评估我们预测的细胞类型注释与完整参考的匹配程度。在这个例子中，我们发现在细胞类型分类上有很高的一致性，超过97%的细胞被正确标记。

pancreas.query$prediction.match <- pancreas.query$predicted.id == pancreas.query$celltype table(pancreas.query$prediction.match) table(pancreas.query$predicted.id) VlnPlot(pancreas.query, c("REG1A", "PPY", "SST", "GHRL", "VWF", "SOX10"), group.by = "predicted.id")

可以看到这几个基因在水平表达量的高低。

未完待续...

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